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無血清傳代培養(yǎng)
黏附因子:如果除掉血清,就必須直接在培養(yǎng)基中加入25-50ug/ml的粘連蛋白或1-5ug/ml的層粘連蛋白用以處理塑料培養(yǎng)器皿的生長表面.用1mg/ml的多聚L-融賴氨酸預處理塑料培養(yǎng)器皿,可增強人類二倍體成纖維細胞的存活率.
蛋白酶抑制劑:利用胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng)后,加入血清可抑制剩余的蛋白水解酶的活性,所以用無血清培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)時必須在無血清培養(yǎng)基中加入如大豆胰蛋白酶抑制劑或0.1mg/ml的牛胰蛋白酶抑制劑等蛋白酶抑制劑.由于粗制胰蛋白酶是由多種蛋白酶組成的復雜的混合物,其中不同的成分需要不同的抑制劑,因而盡量用純的胰蛋白酶及其對應的胰蛋白酶抑制劑.否則就要用離心的方法洗滌細胞以去除胰蛋白酶.在無血清條件下鏈蛋白酶有可能通過被稀釋而失活,不存在一系列的中和作用.
胰蛋白酶和其他蛋白酶:用胰蛋白酶處理無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞時,需要特別注意,因為細胞易碎,可能需要使用純化的結晶胰蛋白酶以及降低胰蛋白酶的溫度以減少細胞的損傷.選擇蛋白酶的種類可以避免動物蛋白來源的物質存留于細胞.用重組的胰蛋白酶可代替提純的prorcine.非哺乳動物蛋白酶也可選用蛋白酶.解離酶,膠原酶是細菌的蛋白酶,不能用胰酶抑制劑使其失活,可能需要用離心的方法去除.在沒有使酶失活的無血清條件下,可以用稀釋的方法使Pronase失活.蛋白酶是非常有效的,但對一些細胞有毒性.如果有上皮細胞存在,用Dispase和膠原酶消化時,不能得到單細胞懸液.
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