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免疫組化操作技巧
點(diǎn)擊次數(shù):2312 更新時(shí)間:2019-03-13

免疫組化ABC法

 

(一)、儀器設(shè)備
   1)18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫(yī)用微波爐;
    2)水浴鍋

(二)、試劑 
    1)PBS緩沖液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
    2)0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(CB,pH6.0,1000ml):檸檬酸三鈉 3g,檸檬酸 0.4g。
    3)0.5mol/L EDTA緩沖液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
    4)1mol/L的TBS緩沖液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris堿,用1N的HCl調(diào)至pH8.0,加水至1000ml。
    5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
    6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
    7)封裱劑:
    a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0~9.5)等量混合;
    b、甘油和TBS(或PBS)配制。 
    8)TBS/PBS pH9.0~9.5,適用于熒光顯微鏡標(biāo)本;pH7.0~7.4適合于光學(xué)顯微鏡標(biāo)本。

(三)、   
    SABC法
    1)脫蠟、水化。
    2)PBS洗兩次各5分鐘。
    3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2,室溫封閉5~10分鐘,蒸餾水洗3次。
    4)抗原修復(fù)。
    5)PBS洗5分鐘。
    6)滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
    7)滴加抗小鼠一抗(合適的濃度),室溫1小時(shí)或者4℃過夜或者37℃1小時(shí) 

  (4℃過夜后在37℃復(fù)溫45分鐘)。
    8)PBS洗三次每次2分鐘。
    9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分鐘。
    10)PBC洗3次每次2分鐘。
    11)滴加試劑SABC,20℃~37℃20分鐘。
    12)PBS洗4次每次5分鐘。
    13)DAB顯色:DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色(鏡下掌握顯色程度)。
    14)蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染2分鐘、鹽酸酒精分化。
    15)脫水、透明、封片、鏡檢。

 

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