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哺乳動物蛋白抽提試劑盒說明書
Mammalian Protein Extraction Kit
貨號： K0889
保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃
其 它 組 分 ： 室 溫
組分說明
Catalog no. K0889 K0889A
Kit Size 25 次 100 次
Mammalian Protein Extraction Reagent 25 ml 100 ml
蛋白酶抑制劑混合物 250 μl 1 ml
產(chǎn)品簡介
哺乳動物蛋白抽提試劑能夠快速，溫和，高效的裂解哺乳動物細(xì)胞，有效提取細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白。該試劑使用溫和配方保證所提取蛋白保持生物學(xué)活性并可應(yīng)用于多種蛋白分析試驗，如：報告基因和酶活性測定，免疫檢測，蛋白純化等。提取后蛋白可采用 BCA 法進(jìn)行蛋白定量分析。哺乳動物蛋白抽提試劑盒中帶有蛋白酶抑制劑混合物，可有效避免蛋白提取過程中蛋白的降解。
注意事項
1. 本產(chǎn)品可有效裂解細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞（無需刮?。┮约半x心收集的懸浮細(xì)胞，較反復(fù)凍融或超聲法具有更高提取效率。但對于組織蛋白的抽提，建議使用組織蛋白抽提試劑（#K0004，#K0891）。
2. 表一中所列的是貼壁細(xì)胞蛋白提取的z佳使用量，如果需要減少試劑用量從而獲得更高的蛋白濃度，建議首先刮取細(xì)胞。
3. 對于離心獲得的細(xì)胞，如果丌知道細(xì)胞的體積，可以根據(jù)細(xì)胞數(shù)量估計抽提試劑的使用量。如2×106個Hela 細(xì)胞約重20 mg，需要加入200μl 抽提試劑，以此類推。
4. 通過本產(chǎn)品提取的蛋白，可通過BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。
操作步驟
● 貼壁細(xì)胞蛋白抽提
1. 小心傾去貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液。
2. 注意：如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響試驗結(jié)果的物質(zhì)，請先使用PBS漂洗細(xì)胞。
3. 請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷， 按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。
注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。
4. 加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，（在冰上用槍頭吹打貼壁細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中），冰上孵育20分鐘，讓細(xì)胞充分裂解（試劑使用量請參考附表1，冰上放置時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型丌同進(jìn)行調(diào)整） 。
5. 14,000×g離心5-10分鐘。
6. 轉(zhuǎn)移上清液至新管中，用于進(jìn)一步分析。
● 懸浮細(xì)胞蛋白提取
1. 將懸浮細(xì)胞2,500×g，離心10分鐘，棄去上清。
2. 可選步驟：漂洗。如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì)，請使用PBS漂洗細(xì)胞。
3. 漂洗后的細(xì)胞懸浮液2,500×g，離心10min，棄去上清。
4. 請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。
注意：在進(jìn)行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。
5. 加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，每100 mg (~100 µl)細(xì)胞至少加入1 ml哺乳動物蛋白抽提試劑。如提取的樣本量較大，可首先使用抽提試劑總使用量的1/10重懸細(xì)胞沉淀，然后加入剩余抽提試劑。
6. 吹打均勻后，冰上放置20分鐘，讓細(xì)胞充分裂解（冰上放置時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型丌同進(jìn)行調(diào)整）。
7. 14,000×g離心15分鐘。
8. 轉(zhuǎn)移上清至新管中，進(jìn)行下一步分析。
注：每100 mg細(xì)胞約可提取到6 mg的總蛋白（細(xì)胞類型丌同略有差異）。
參考附表
表 1. 抽提試劑使用量推薦表
細(xì)胞培養(yǎng)板類型或平皿類型 抽提試劑使用量
100 mm 500-1,000 µl
60 mm 250-500 µl
6 孔培養(yǎng)板 200-400 µl /孔
24 孔培養(yǎng)板 100-200 µl /孔
96 孔培養(yǎng)板 50-100 µl/孔
* 對于 100 mm 培養(yǎng)板培養(yǎng)的107個細(xì)胞 (50 mg)可裂解獲得約3 mg 總蛋白（細(xì)胞類型不同略有差異）。
2. 常見問題及解決辦法
1. 低提取率
可能原因：
a低蛋白表達(dá)量
b試劑使用量不夠
c試劑無法溶解細(xì)胞膜
解決方法：
a優(yōu)化轉(zhuǎn)染系統(tǒng)
b增加抽提試劑使用量
c增加裂解時間或者加大晃動幅度
2. 無法獲得膜蛋白
可能原因：用哺乳動物蛋白抽提試劑提取核/漿蛋白
解決方法：使用真核細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒
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