細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞純化更進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細(xì)胞的過(guò)程。
分離和純化細(xì)胞的過(guò)程不僅僅在原代培養(yǎng)之前進(jìn)行的，有時(shí)分離和純化細(xì)胞的過(guò)程還貫穿于原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的過(guò)程中，甚至是主要依賴培養(yǎng)過(guò)程實(shí)現(xiàn)分離和純化細(xì)胞的目的。
細(xì)胞分離液是一種經(jīng)過(guò)聚乙烯吡咯烷酮處理過(guò)的硅膠顆粒，經(jīng)過(guò)高速離心后可形成連續(xù)密度梯度，由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。分離液采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿意的細(xì)胞分離結(jié)果。此外，分離液不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。常用于分離和傳話植物原生質(zhì)體、核、葉綠體、和線粒體。
細(xì)胞分離液的配置與使用
1、不同濃度(密度)分離液的制備:先用9份分離液與1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15MPBS)稀釋到所需濃度。
2、不連續(xù)密度梯度層的制備:先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過(guò)程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層比重相差不大時(shí)，可將液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
3、裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過(guò)大，細(xì)胞濃度也不可過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。
4、離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。
5、取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于層中,則需要逐層收集。收獲含有液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。
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