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血液RNA提取試劑盒說明書
RNApure Blood Kit
Cat. No. K0582
保存：室 溫
組分說明
Cat. No. K0582
Kit Size 50
Buffer RBL（10×） 60 ml
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Shredder Spin Column 50
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 100
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒適用于從新鮮全血（用檸檬酸鹽、EDTA 或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品）中提取總 RNA，可以處理多至1.5 ml 的全血，洗脫得到分子量大于 200 bp 的高純度 RNA，多個(gè)樣品可以在 1 小時(shí)內(nèi)同時(shí)完成。本產(chǎn)品無需 CsCl 純化的超離心步驟和 LiCl 或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶劑，經(jīng)過純化的 RNA 有效去除血紅素、肝素等酶抑制劑和污染物，可直接用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 預(yù)防 RNase 污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1） 使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2） 玻璃器皿應(yīng)在使用前于 180℃高溫下干烤 4 小時(shí)，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3） 配制溶液應(yīng)使用無 RNase 的水。
4） 操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。
2. 樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質(zhì)量。樣品在 Buffer RL 中，可于-70℃保存一個(gè)月。
3. 使用前請(qǐng)檢查 Buffer RL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可置于 56℃水浴重新溶解。Buffer RL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇，
至終濃度為 1%。如 1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個(gè)月。
4. 第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。
5. 本試劑盒不能用于加入抗凝劑的冷凍血液樣本 RNA 的提取。
6. 10×Buffer RBL 需在使用前將溶液用無 RNase 的水進(jìn)行 10 倍稀釋，稀釋后置于 2-8℃保存。
7. 若下游實(shí)驗(yàn)對(duì) DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號(hào)：K2090A）對(duì) RNA 進(jìn)行處理。
自備試劑： β-巰基乙醇、70%乙醇（用無 RNase 的水配制）、無水乙醇
操作步驟
1. 向0.5-1.5 ml 新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍體積的1×Buffer RBL（請(qǐng)于使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL 稀釋10倍），輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鐘，孵育過程中混勻兩次。
注意：孵育過程中渾濁的懸液會(huì)變成透明，證明紅細(xì)胞被裂解，必要時(shí)可以把孵育時(shí)間延長(zhǎng)至20分鐘。
2. 4℃ 2,100 rpm（~400×g）離心10分鐘，小心吸棄上清。
3. 向以上沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Buffer RBL（請(qǐng)于使用前用無RNase的水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋，充分重懸沉淀。
4. 4℃ 2,100 rpm離心10分鐘，小心并*吸棄上清。
注意：此步一定要*去除上清否則影響裂解導(dǎo)致RNA產(chǎn)量下降。
5. 向沉淀中加入Buffer RL（使用前檢查是否已經(jīng)加入β-巰基乙醇），0.5-1.5 ml血液樣本加入600 μl Buffer RL，或小于0.5 ml 血液樣本加入350 μl Buffer RL，混勻。
6.將所得液體轉(zhuǎn)移到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，收集濾液，棄掉過濾柱。
7.向所得濾液中加入1倍體積（600 μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。
注意：加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
8.將上步所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入700 μl Buffer RW1，12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
可選步驟：如果要進(jìn)行對(duì)微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，則用以下步驟替代步驟9。
1）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2）配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1 U/μl），混勻， 配制成終體積為80 μl 的DNase I混合液。
注意: 以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I （K2090A）反應(yīng)體系進(jìn)行配置，應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請(qǐng)參考相應(yīng)說明書。
3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。
4）向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
11. 重復(fù)步驟10。
12. 12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR 等）。
13. 將吸附柱置于一個(gè)新的無RNase離心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位加入30-50 μl RNase-Free
Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1）RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30 μl，體積過小影響回收率。
2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟13。
3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟13。
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