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氯——#霉素
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氯霉素的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度： 0.02ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
u 樣本檢測下限
蛋類、牛奶（方法一） ···························· 0.04ppb
尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.02ppb
組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.01ppb
u 交叉反應率
氯+#霉素· ······································· 100%
甲砜+#霉素 ······································ < 0.1%
氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%
u 樣本回收率
組織、肝臟 ································ 85%±20%
蜂蜜、腸衣 ································ 83%±25%
牛奶、飼料 ································ 75%±23%
尿液、血清 ································ 70%±18%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔，一板12條 | |
2 | 標準液×6瓶 （1ml/瓶） | 0ppb | 0.02ppb |
0.06ppb | 0.18ppb | ||
0.54ppb | 1.62ppb | ||
3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
4 | 抗體濃縮液 | 1ml | 藍色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 2X濃縮復溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵氰+#化鈉、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制：
配液1 C液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵氰+#化鈉加去離子水100ml溶解。
配液2 D液（牛奶、奶粉樣本）：
28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。
配液3 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。
配液4 乙腈-水溶液：
V乙腈：VH2O＝84：16
配液5 樣本復溶液：
將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復溶液+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復溶)。
u 樣本處理：
（a）組織、肝臟樣本處理方法
1、 稱取均質后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，先加入3ml去離子水混勻后再加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；
2、 取出4ml上層液體在50-60℃氮氣流中吹干；
3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；
4、 取50 µl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 0.5倍
（b）血清血漿處理方法
1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；靜置使水相與有機相分層或室溫4000r/min離心5min；
2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流50℃水浴中干燥；殘留物用1 ml樣本復溶液溶解，混合30s；
3、 取50 µl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
（c） 尿液處理方法
1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；加40µl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時（或過夜）；
2、 該溶液恢復至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮氣下50～60℃干燥；
3、 用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
4、 取50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù): 1倍
（d）蜂蜜處理方法
1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；
2、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮氣流下干燥；用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
3、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)： 0.5倍
檢測下限：0.025ppb 定量下限：0.1 ppb
注：我們推薦0.1 ppb為陽性樣本的cut off值。
（e）腸衣處理方法
1、 用均質器均質樣本；注：干樣本需剪碎（長度不超5mm）后再均質，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質；
2、 稱1±0.05g均質后的樣本于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；
3、 取5ml上層液體（相當于0.5g的樣本）在氮氣流下50-60℃干燥；
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml樣本復溶液振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；除上層有機相；
5、 取下層50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)： 1倍
（f）牛奶樣本處理方法一
1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入150µl C液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150µl D液混合；
2、 15℃4000r/min以上離心10min，移取上層液；用樣本復溶液以等體積稀釋上層液，混合30s；
3、 取50µl用于分析。
注：如果離心后仍然渾濁，再重復沉淀過程。
樣本稀釋倍數(shù)：2
檢測下限：0.1ppb 定量下限：0.15ppb
（g）牛奶樣本處理方法二
1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入250µl C液和250µl D液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到8℃；
2、 轉移出2.2ml上層液（相當于2ml奶樣）至新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上振蕩2min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ；
3、 吸取2ml乙酸乙酯上層液體（相當于1ml奶樣），50-60℃氮氣流下*干燥；用0.5ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
4、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5
檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些
情況下干擾數(shù)值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結果的CUT OFF判斷值。
（h）奶粉樣本處理方法
1、 稱2±0.05 g奶粉至50ml離心管中，加入10ml去離子水振蕩溶解；加入1ml C液和1ml D液*混合；4-12℃4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機，請預先將樣本冷卻到8℃；
2、 轉移出3.6ml上層液（相當于0.6g奶粉）至新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min；
3、 吸取4ml乙酸乙酯上層液體（相當于0.4g奶粉），50-60℃氮氣流下*干燥；用0.4ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
4、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標準2到3之間），所以推薦標準3作為陽性結果的CUT OFF判斷值。
（i）蛋類處理方法
1、 稱取3±0.05 g均質的樣本，加入9ml乙腈-水溶液振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min；
2、 取3ml上層相與3ml去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合1min，15℃4000r/min以上離心10min；取上層有機相置50-60℃下氮氣流吹干；
3、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；
4、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2
檢測下限：0.1ppb 定量檢測限：0.3ppb
（j）飼料處理方法
1、 稱取2±0.05g均質過的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；
2、 取3ml上層有機相到試管中56℃下氮氣吹干；
3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml樣本復溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機相；
4、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
六、 酶標免疫分析程序:
u 測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟：
1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、 將濃縮抗體用樣本復溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用）
6、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。
7、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
9、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
10、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氯霉素量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.02ppb為1.816；0.06ppb為1.415；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313；1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
從2011年開始我們致力于在生命科學領域、生物醫(yī)學實驗外包及論文潤色服務，協(xié)助客戶各類實驗服務及論文潤色，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!
如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究，歡迎您與我們聯(lián)系。
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