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Taq DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)
貨號(hào)：K0680
保存條件：-20℃保存。
組分說(shuō)明
Cat. No. K0680 K0680E K0680F
Kit Size 500 U 6×500 U 5×2000 U
Taq DNA Polymerase, 5 U/μl 100 μl 6×100 μl 5×400 μl
10×Taq PCR Buffer with Mg2+ 2×1 ml 3×5 ml 8×5 ml
注意：本產(chǎn)品的10×Taq PCR Buffer中含有15 mM鎂離子。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
Taq DNA Polymerase是通過(guò)大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶。其基因來(lái)源于Thermus
aquaticus polymerase。該蛋白分子量為94 kDa，具有5′→3′ DNA聚合酶活性和5′→3′外切核酸酶活性，無(wú)3′→5′外切核酸酶活性，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物3′端附有一個(gè)“A"堿基，因此可直接用于 T/A克隆。本產(chǎn)品具有延伸速度快、擴(kuò)增效率高的特點(diǎn)，主要適用于PCR法擴(kuò)增DNA片段、DNA序列測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。
活性定義
用活性化的大馬哈魚(yú)精子DNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內(nèi)，將10 nmol脫氧
核苷酸摻入到酸性不溶物質(zhì)所需的酶量定義為1個(gè)活性單位（U）。
質(zhì)量控制
經(jīng)過(guò)多次柱純化， SDS-PAGE檢測(cè)其純度大于99%；經(jīng)檢測(cè)無(wú)外源核酸酶活性；
PCR方法檢測(cè)無(wú)宿主殘余DNA；能有效地?cái)U(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一
個(gè)月，無(wú)明顯活性改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的
片段大小不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。
1. PCR反應(yīng)體系
試劑 50 μl體系 終濃度
10×Taq PCR Buffer with Mg2+ 5 μl 1×
dNTP Mix，2.5 mM each 4 μl 200 μM each
Forward Primer，10 μM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 μM 2 μl 0.4 μM
Template DNA <1 μg <1 μg/reaction
Taq DNA Polymerase，5 U/μl 0.25 μl
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：1）引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2）鎂離子濃度請(qǐng)以終濃度1.5-3 mM作為設(shè)定范圍的參考。本產(chǎn)品的10×PCR Buffer中已經(jīng)含有15 mM鎂離子，可根據(jù)不同的引物對(duì)和模板來(lái)調(diào)節(jié)鎂離子濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。
2. PCR反應(yīng)條件
步驟 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 94℃ 2 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 25-35個(gè)循環(huán)
延伸 72℃ 30 s
終延伸 72℃ 2 min
注意：1）一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，無(wú)法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。
2）延伸時(shí)間應(yīng)根據(jù)所擴(kuò)增片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品Taq DNA Polymerase的擴(kuò)增效率為1 kb/30 s。
3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
3.結(jié)果檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電
泳檢測(cè)。
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