間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化試劑盒
,成軟骨誘導液
貨號：YJ-MSCYD-003
價格： 1980.0
規(guī)格： 100ml 200ml
產(chǎn)品描述
本產(chǎn)品為團隊精心優(yōu)化的間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導分化試劑盒，可增強間充質(zhì)干細胞向成軟骨細胞分化的能力。
本產(chǎn)品僅用于科研用途，不可用于診斷、治療、臨床、家庭及其他用途。
產(chǎn)品組成成分及保存
試劑名稱 | 體積（100mL規(guī)格/200mL規(guī)格） | 保存條件 |
誘導分化添加劑Ⅰ | 5mL / 10mL | -20℃，1 Year |
誘導分化添加劑Ⅱ | 1mL / 2mL | -20℃，1 Year |
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 | 10mL / 20mL | -20℃，1 Year |
細胞基礎培養(yǎng)基 | 84mL / 168mL | 4℃，1 Year |
甲苯胺藍染色液 | 5mL / 10mL | RT（室溫），1 Year |
? 注意：1.為保證產(chǎn)品的有效性，請避免反復凍融。
2. 誘導分化添加劑Ⅱ須現(xiàn)用現(xiàn)配，加入培養(yǎng)基后，須在12小時內(nèi)用完，否則可能影響實驗效果。
3. 配制好的誘導分化預混液（不含誘導分化添加劑Ⅱ）保存于2-8℃，有效期為2周。
產(chǎn)品使用說明（2D/3D培養(yǎng)）
1. 成軟骨誘導分化培養(yǎng)基的配制
①室溫條件下融化添加劑及血清。（注意：若添加劑或血清中有沉淀物，屬正常現(xiàn)象，無須過濾，避免成分丟失。）
②配制誘導分化預混液：以下簡稱預混液。根據(jù)實驗用量，于無菌操作臺中配制。建議每次配制50mL，先加細胞基礎培養(yǎng)基和胎牛血清，再加誘導分化添加劑。（配制比例見表一）
試劑成分 | 配制比例 | 50mL配制體系 |
誘導分化添加劑Ⅰ | 5% | 2.5mL |
優(yōu)質(zhì)胎牛血清 | 10% | 5mL |
| 85% | 42.5mL |
③配制誘導分化完全培養(yǎng)基：根據(jù)實驗用量，按照1%的比例向預混液中添加誘導分化添加劑Ⅱ，如每1mL預混液添加10uL誘導分化添加劑Ⅱ。（注意：誘導分化添加劑Ⅱ須現(xiàn)用現(xiàn)加，配制完成的誘導分化完全培養(yǎng)基12h內(nèi)使用完，否則將失效。）
2. 2D成軟骨誘導分化實驗步驟
①建議取第3~5代、純度達90%以上、狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞，將其消化下來，離心收集，使用含10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度，均勻鋪于培養(yǎng)瓶/板中。將接種好的細胞置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（細胞接種詳情參考表二）
培養(yǎng)器皿 | 底面積 | 細胞量 | 培養(yǎng)液體積 |
24孔培養(yǎng)板 | 2cm/孔 | 2×105cell/孔 | 1mL/孔 |
12孔培養(yǎng)板 | 4.5cm/孔 | 4.5×105cell/孔 | 2mL/孔 |
6孔培養(yǎng)板 | 9.6cm/孔 | 9.6×105cell/孔 | 2mL/孔 |
T25培養(yǎng)瓶 | 25cm | 25×105cell | 5mL |
6cm培養(yǎng)皿 | 21cm | 21×105cell | 5mL |
10cm培養(yǎng)皿 | 55cm | 55×105cell | 10mL |
表二
②待細胞匯合度達80%~100%時，即可進行誘導分化。
③小心吸棄細胞培養(yǎng)上清，沿孔壁緩慢加入提前配制好的誘導分化完全培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（注意：完全培養(yǎng)基加入細胞前需提前置于37℃預熱。）
④每2day~3day換用新鮮的誘導分化完全培養(yǎng)基。換液時，若細胞培養(yǎng)上清顏色變?yōu)槌吻宓狞S色，是由于細胞量較大，培養(yǎng)基消耗較快導致的，請及時調(diào)整為每日換液。（注意：完全培養(yǎng)基加入前需提前置于37℃預熱。）
⑤細胞誘導3周后，即可進行甲苯胺藍染色鑒定。
3. 2D成軟骨細胞甲苯胺藍染色分析
①細胞誘導分化結(jié)束后，小心吸棄細胞培養(yǎng)上清，1×PBS潤洗1~2次，室溫固定30 min。（細胞固定液為4%中性甲醛溶液等，體積參考表二）
②吸棄細胞固定液，1×PBS潤洗2次。沿孔壁緩慢加入甲苯胺藍染色液，染液體積請參考表二，室溫染色30min。（注意：染色液底部可能會有沉淀，吸取時盡量不要觸及底部。若染色后有沉淀，1×PBS洗去即可。）
③吸出染色液，1×PBS潤洗，去掉浮色。顯微鏡下觀察細胞染色效果，背景呈淡藍色，成軟骨細胞呈紫紅色。（注意：染色液可重復使用，建議收集。）
4. 3D成軟骨誘導分化實驗步驟
①建議取第3~5代、純度達90%以上、狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞，將其消化下來，計數(shù)。調(diào)整細胞濃度，按照每管3~4×105cell將細胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，20℃，250×g離心4min。
②棄上清，每管加入0.5mL預混液，重懸細胞沉淀。20℃，150×g離心5min。
③棄上清，每管加入0.5mL成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，20℃，150×g離心5min。
④將離心管樹立放置于37℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擰松離心管蓋以便于氣體交換。（注意：此步驟無需重懸細胞，且24h內(nèi)不可晃動離心管。）
⑤約24h~48h后，細胞出現(xiàn)聚團現(xiàn)象，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮于培養(yǎng)液中。
⑥每2~3day換用新鮮的誘導分化完全培養(yǎng)基，持續(xù)誘導三周后，即可將培養(yǎng)液更換為固定液（4%中性甲醛），將軟骨球固定，后續(xù)進行切片染色鑒定實驗。
質(zhì)量控制
無菌檢測（細菌、真菌和支原體檢測）
pH測試
滲透壓檢測
內(nèi)毒素
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注意事項
僅限科研用。
培養(yǎng)體系中的一些組分是對人體健康有害的物質(zhì)，請不要用暴露的皮膚接觸培養(yǎng)體系的液體和有培養(yǎng)體系的液體殘留的容器內(nèi)部；這部分有害物質(zhì)的濃度和危害性都較低，如有接觸，立即用自來水沖洗即可。
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