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琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒說明書 |
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琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒說明書 微量法 正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定 測定意義 SDH（EC 1.3.5.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中。SDH是線粒體的一種標志酶，位于線粒體內膜上的一種膜結合酶，是連接呼吸電子傳遞和氧化磷酸化的樞紐之一。 此外，為多種原核細胞產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子。 測定原理 SDH 催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下的氫通過吩嗪二甲酯硫酸（PMS）傳遞還原2,6- 二氯酚靛酚（DCPIP），并且在600nm 處具有特征吸收峰，通過600nm吸光度的變化，測定2．6-DPIP 的還原速度，代表SDH 酶活性。 需自備的儀器和用品 可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 試劑一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 試劑三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存； 試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存； 樣本的前處理 組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離： 1、稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。 2、將勻漿600g，4℃離心5min。 3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。 4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的SDH（此步可選做）。 5、 在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎, 冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于線粒體SDH活性測定。 測定步驟和加樣表 1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至600nm，蒸餾水調零。 2、樣本測定 （1）在試劑四中加入18mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴10min；用不完的試劑4℃保存一周； （2）在試劑五中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存一周； （3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL試劑四，混勻，立即記錄600nm處20s時的吸光值 A1和1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。 SDH 活性的計算 a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （1） 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T =952×ΔA÷Cpr （2） 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T=192×ΔA÷W （3） 按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.385×ΔA V 反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×10 4 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。 b.用96孔板測定的計算公式如下 （1） 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =1904×ΔA÷Cpr （2） 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=384×ΔA÷W （3） 按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 SDH 活性（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.77×ΔA V 反總：反應體系總體積，2×10 -4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
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