產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Trizol(總 RNA 提取試劑)

Trizol 是一種新型的用于細(xì)胞或組織的總RNA提取試劑，Trizol采用不

Invitrogen TRIzol相似的原理和方法，其顏色、抽提的方法和步驟不后者*相同。

Trizol 含酚和異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速裂解細(xì)胞或組織并且滅活核酸酶，保持

RNA 的完整性。加入氯防仿并離心后，溶液形成上清層為水相(無(wú)色)、中間層、下層為有機(jī)相(紅色)。上清層用異丙醇沉淀回收總 RNA，中間層用乙醇沉淀回收 DNA，下層用異丙醇沉淀回收蛋白。

Trizol 適用于從各種組織或細(xì)胞中快速分離總RNA，既可用于小量樣品(50～

100 mg 組織、5×10 細(xì)胞)，也可用于大量樣品(>1g 組織/>10細(xì)胞)。提取的總RNA質(zhì)

量高，可用于 North⁶ern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆。本產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：①適用范圍廣；②操作簡(jiǎn)單，整個(gè)過(guò)程 1 小時(shí)內(nèi)完成；③

純度高；④污染少。

產(chǎn)品組成：

Trizol Reagent

100ml 4℃ 避光

自備材料：

1、試劑：無(wú)水乙醇、氯防仿、異丙醇、DEPC處理水等。

2、耗材：RNase 廣泛存在于人的皮膚上和體液及環(huán)境中，RNase 是導(dǎo)致 RNA降解的最主要物質(zhì)，非常穩(wěn)定。操作時(shí)應(yīng)佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金屬物品、 實(shí)驗(yàn)儀器等應(yīng)清除 RNase，移液器吸頭、EP 管等制品的 RNase free處理尤為重要。

3、儀器：低溫高速離心機(jī)、低溫冰箱。

操作步驟(僅供參考)：

1、樣品準(zhǔn)備

⑴貼壁細(xì)胞：

①直接裂解：直接在培養(yǎng)瓶/皿中加入 Trizol 裂解細(xì)胞，每 10cm 面積加 1ml Trizol，用移液器吹打混勻。 ²

②胰蛋白酶消化：用無(wú)菌  PBS 洗滌細(xì)胞后，加入含有  0.05～0.25%胰蛋白酶的  PBS 處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase 的離心管中，5000～6000g 離心 5 min，收集細(xì)胞沉淀，去除上清。收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則裂解不*，降低 RNA收獲率。

⑵懸浮細(xì)胞：無(wú)需清洗細(xì)胞，直接 5000～6000 g 離心 5 min，收集細(xì)胞。每 5×10 ～10

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動(dòng)⑶物組、織植：物取和新酵鮮母動(dòng)細(xì)物胞或或者每植物1組0 織或細(xì)者菌-細(xì)7胞0℃加凍入存1組m織l ，Tr5i0z～o1l0。0mg 組織在液氮中充分研

磨或者加入  1ml Trizol 研磨或者用勻漿器勻漿處理。樣品體積一般不超過(guò)  Trizol體積的

10%。研磨要迅速，以 1min為佳。

⑷血液：取 0.5～1 ml 新鮮或凍存的血液，12000g 離心 5 min，去除血漿，加入 1ml Trizol， 充分振蕩混勻。

2、核酸分離：充分振蕩混勻(可以置于低溫/超低溫冰箱凍存 5～10 min 后，充分振蕩，反

復(fù) 1～3 次)，將裂解樣品或勻漿液室溫放置 5～10 min，使核蛋白不核酸*分離。

3、樣品分層：加入 0.2 ml 氯防仿/1ml Trizol，劇烈振蕩 15s，室溫放置 2～3 min。置于 4℃離心機(jī)，12000 g 離心 10～15 min。上層為水相，中間層和下層為有機(jī)相，RNA在上層水相。

4、沉淀 RNA：吸取上層水相(約  500μl)轉(zhuǎn)移至無(wú) RNase 的離心管中(不要吸取任何中間層物質(zhì),否則會(huì)有染色體DNA污染)，加入等體積異丙醇混勻(或者加入1.2倍體積Trizol與用  RNA沉淀液，超低溫冰箱放置 2～3hr,可以大大提高 RNA回收率），室溫放置 15～20 min。12000g 4℃離心 10min，離心后管側(cè)或管底形成膠狀沉淀，棄上清。

5、洗滌 RNA：加入 1ml DEPC水配制的 75%乙醇/1ml Trizol洗滌沉淀(或者加入1ml

Trizol與用RNA洗滌液，可以大大提高RNA純度），室溫放置5～10min，7500g 4℃離心5 min，棄上清。室溫干燥5～10min，不宜過(guò)分干燥，否則 RNA難以溶解。

6、溶解 RNA：加入30～50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA，-70℃長(zhǎng)期保存或直接用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)于肝、胰腺、腎等組織中 RNase 含量高的樣品，沉淀時(shí)用100%去離子甲酰胺溶解。

分析與定量：

1、測(cè)定樣品在 260nm 和 280nm的吸收值確定  RNA 的質(zhì)量。按  1OD=40pg RNA計(jì)算

RNA的產(chǎn)率。OD260/280 在  1.8～2.0 視為抽提  RNA 純度較好。濃度在 4μg/ml以上的樣品適于用分光光度計(jì)測(cè)定。

2、進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。

3、核酸分析儀測(cè)定RNA的質(zhì)量和純度。

注意事項(xiàng)：

1、樣品保存：加入 Trizol 混勻后，樣品可在-70℃放置 1～2 月；RNA 樣品可以在 70%酒精中-70℃保存 2～4 周：如果需要長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于超低溫冰箱中保存。

2、Trizol是強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，污染皮膚或眼睛后，立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求 醫(yī)生的幫助。

3、Trizol 可常溫運(yùn)輸，建議保存 4℃保存。

4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期：12 個(gè)月有效。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因

抽提得到的RNA沉淀未*溶解。

水相中混有有機(jī)相，從而存在蛋白質(zhì)和 DNA污染。

A260/ A280＜1.6 RNA樣品用水而不是 TE溶解。低離子濃度和低 pH 條件下，A280值會(huì)偏高。樣品勻漿時(shí)加的  Trizol 試劑太少，RNA 不蛋白質(zhì)、DNA未能*分離。

勻漿后樣品未在室溫放置或者放置時(shí)間太短，RNA不核蛋白未*解離。

樣品中含組織溶劑(如乙醇等)或堿性溶液，致水相減少或 pH升高。

DNA 污染

樣品勻漿時(shí)加入的試劑體積太少。如果存在 DNA污染，可用 DNA清除劑去除。水相中混有有機(jī)相，從而存在蛋白質(zhì)和 DNA污染。

RNA 產(chǎn)量低

RNA 降解

蛋白和多糖污染

樣品裂解或勻漿處理不徹底，RNA沒(méi)有被*釋放出來(lái)。得到的 RNA沉淀未*溶解。

抽提的RNA中含有 RNase。

組織或細(xì)胞不新鮮，樣品沒(méi)有及時(shí)被液氮凍存，導(dǎo)致組織或細(xì)胞中的 RNA 降解。溶液或離心管未經(jīng) RNase free 處理，RNase 的污染導(dǎo)致RNA被降解。

細(xì)胞在胰蛋白酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致未加  Trizol 前 RNA已經(jīng)部分降解。

電泳時(shí)使用的甲酰胺 pH小于 3.5，導(dǎo)致 RNA發(fā)生酸解。水相中混有有機(jī)相，從而帶有蛋白質(zhì)和 DNA。樣品中蛋白、多糖含量高或樣品量太大，細(xì)胞未裂解*。