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豚鼠臟器組織中性粒細(xì)胞分離液試劑盒

本品為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用

于從人或各種動(dòng)物血液或臟器組織中分離中性粒細(xì)胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)

用。其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散系數(shù)及

細(xì)胞帶電不同，所以用戶在定制分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物的種屬及被分離細(xì)

胞的名稱(chēng)。

臟器組織分離液試劑盒系列產(chǎn)品目錄

1. 適用于人或各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項(xiàng)

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

6. 貯藏及保存期限

7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

8. 人或各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液使用方法說(shuō)明及圖例

9. 組織單細(xì)胞懸液的制備

10. 紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明

11. 人或各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說(shuō)明及圖例

12. 生產(chǎn)企業(yè)

13. 參考文獻(xiàn)

1. 適用于人或各種動(dòng)物血液及 各種動(dòng)物血液及 各種動(dòng)物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索：：：：

貨號(hào)                     品牌              產(chǎn)品名稱(chēng)          規(guī)格         報(bào)價(jià)

2...相關(guān)試劑 2. 相關(guān)試劑及耗材

A．．．． 試劑

貨號(hào) 名稱(chēng) 規(guī)格 價(jià)格

2010C1119 全血及組織稀釋液 500ml 400.00

2010X1118 細(xì)胞洗滌液 500ml 200.00

Y2013TBD 組織勻漿液 150ml 150.00

NH4CL2009 紅細(xì)胞裂解液 100ml 150.00

B．．．． 耗材

貨號(hào) 名稱(chēng)及規(guī)格 生產(chǎn)廠商 價(jià)格

3516 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 50 塊/箱 Costar 686.00

3513 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 50 塊/箱 Costar 675.00

3524 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1287.00

3548 48 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1542.00

3599 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1367.00

430168 25CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 20 個(gè)/包 Corning 113.00

430639 25CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 20 個(gè)/包 Corning 132.00

430720 75CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個(gè)/包 Corning 56.00

430641 75CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個(gè)/包 Corning 59.00

430823 150CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個(gè)/包 Corning 102.00

430825 150CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個(gè)/包 Corning 107.00

431079 175CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個(gè)/包 Corning 133.00

431080 175CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個(gè)/包 Corning 139.00

431081 225CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個(gè)/包 Corning 167.00

431082 225CM 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個(gè)/包 Corning 176.00

430790 15ml 離心管（含泡沫架） 50 支/包 Corning 92.00

430828 50ml 離心管（含泡沫架） 25 支/包 Corning 55.00

430776 250ml 離心管 102 支/箱 Corning 1176.00

4485 1ml 移液管 50 支/包 Costar 55.00

4486 2ml 移液管 50 支/包 Costar 63.00

4487 5ml 移液管 50 支/包 Costar 92.00

430659 2ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 117.00

430663 5ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 131.00

GP2012 玻璃吸管 10 支/包 TBD 30.00

GT201210 10ml 玻璃離心管 10 支/包 TBD 90.00

GT201250 50ml 玻璃離心管 5 支/包 TBD 120.00

L147 100/200 目不銹鋼濾網(wǎng) TBD 150.00

3. .. 注意事項(xiàng) 3. 注意事項(xiàng)

A． 本分離液是敏光型的，在運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細(xì)胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時(shí)分離效果，

且所有操作過(guò)程一定要在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

C． 由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時(shí)間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實(shí)驗(yàn)室自定）。

D． 使用無(wú)靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過(guò)堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過(guò)程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

F． 分離過(guò)程中所用其他試劑如：羥乙一基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液及

紅細(xì)胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無(wú)菌、無(wú)病毒、無(wú)支原體、

低內(nèi)毒素水平且無(wú)細(xì)胞毒性，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。

4. .. 應(yīng) 用

適用于從人或各種動(dòng)物血液或臟器組織中分離中性粒細(xì)胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標(biāo)

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無(wú)菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清 澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，，

含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無(wú)微生物污染，啟封后可置 4℃長(zhǎng)期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時(shí)本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. .. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 7. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

A． 試劑

中性粒細(xì)胞分離液(試劑盒所含試劑)、全血及組織稀釋液、細(xì)胞洗滌液、紅細(xì)胞裂解液、

組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管

水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、無(wú)菌工作臺(tái)

8.. . . 各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液 各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液 各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液使用方法說(shuō)明及圖例 使用方法說(shuō)明及圖例

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份本分離液之液面上；或取 1ml 組織單細(xì)胞懸液（具體制備方法詳見(jiàn) 9.組織單細(xì)胞懸液的制備）小心加于 1 份本分離液之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)。

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環(huán)狀乳白色的單個(gè)

核細(xì)胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細(xì)胞 富集一定量的中性粒細(xì)胞 富集一定量的中性粒細(xì)胞）。。。。第四層；為紅細(xì)胞層。棄去*層血漿層及第二層細(xì)胞，收集第三層分離液層和第四層紅細(xì)胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細(xì)胞層,放入含細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉(zhuǎn)/分）離心30 分鐘。沉淀經(jīng) 1 次洗滌后用紅細(xì)胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細(xì)胞，再經(jīng) 3 次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細(xì)胞即為所需中性粒細(xì)胞。

注：A.提取率約為 80%。

注

B. 紅細(xì)胞裂解過(guò)程詳見(jiàn)“10.紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明”。

血液（人）中各細(xì)胞含量參考值 中各細(xì)胞含量參考值 中各細(xì)胞含量參考值：：：：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬(wàn)個(gè)/mm3)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬(wàn)個(gè)/mm3 紅細(xì)胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬(wàn)個(gè)/mm3)

成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000 個(gè)/mm3) 白細(xì)胞 新生兒：15.0-20.0×109/L（15000-20000 個(gè)/mm3) 血小板 100-300×109/L（10 萬(wàn)-30 萬(wàn)個(gè)/mm3) 名稱(chēng) 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 占白細(xì)胞總數(shù)百分比 嗜中性粒細(xì)胞 30%-70% 嗜酸性粒細(xì)胞 0.5%-5% 嗜堿性粒細(xì)胞 0%-1% 淋巴細(xì)胞 20%-40% 白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)單核細(xì)胞 3%-8%

9.. . . 組織單細(xì)胞懸液的制備 組織單細(xì)胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法 本說(shuō)明只提供機(jī)械勻漿制備單細(xì)胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實(shí)驗(yàn) 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn) 酶消化法由于各實(shí)驗(yàn)室選取的消化

酶種類(lèi)各不相同，，，，請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn) 請(qǐng)各實(shí)驗(yàn)室自行選擇進(jìn)行試驗(yàn)。。。。

B. .. 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 B. 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境 全過(guò)程及所需試劑要求無(wú)菌環(huán)境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購(gòu))過(guò)濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾去細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集細(xì)胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107 個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法: 細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，均須制備分散的細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，

對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1m（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：：：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm2 時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混

勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)

胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否則要重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤： 初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：：：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

10.. . . 紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明 紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明

本裂解液有別于市場(chǎng) 本裂解液有別于市場(chǎng)上銷(xiāo)售的其它紅細(xì)胞裂解液，，，，其配方經(jīng)過(guò)本公司優(yōu)化在裂解紅細(xì) 其配方經(jīng)過(guò)本公司優(yōu)化在裂解紅細(xì)胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte) 胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte) (lymphocyte)或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞 或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞 或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞，，，，所獲得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài) 得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。。。。另外，，，，本裂解液中無(wú)DNA及RNA酶，，，，配合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)， 合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，，，請(qǐng)廣大用戶從優(yōu)選擇 請(qǐng)廣大用戶從優(yōu)選擇 請(qǐng)廣大用戶從優(yōu)選擇。。。。 紅細(xì)胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱(chēng)ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細(xì)胞樣品中裂解并去除無(wú)細(xì)胞核紅細(xì)胞的溶液。 本裂解液不適用于有細(xì)胞核紅細(xì)胞的裂解，例如鳥(niǎo)或禽類(lèi)的紅細(xì)胞。本裂解液經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理，處理過(guò)的血液或組織細(xì)胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測(cè)。

使用說(shuō)明：：：：

A. .. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品 A. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品 對(duì)于組織細(xì)胞樣品：：：：

a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B. .. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟 B. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟 對(duì)于組織細(xì)胞樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 對(duì)于0.2ml細(xì)胞沉淀加入1ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫 或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不 會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：：：：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也 更好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同 時(shí)需要大體積的離心管。

C. .. 對(duì)于血液樣品 C. 對(duì)于血液樣品：：：：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體 積為1ml，則加入6-10ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠 的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間至4-5分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不 會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心 2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：：：：對(duì)于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進(jìn)行離心棄上清的操作，直接在第二步 中加入10倍血液體積的紅細(xì)胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對(duì)于鼠的血液，裂解4-5 分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且 裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。后續(xù)步驟相同。

D. .. 對(duì)于血液樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟 D. 對(duì)于血液樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟 對(duì)于血液樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室 溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜 延長(zhǎng)裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促 進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不 會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：：：：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更 好一些，同時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí) 需要大體積的離心管。

11.. . . 人或各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說(shuō)明及圖例 各種動(dòng)物中性粒細(xì)胞分離液試劑盒使用方法說(shuō)明及圖例

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：2×100ml/Kit

試劑盒內(nèi)容：全血及組織稀釋液 100ml

細(xì)胞洗滌液 100ml

試劑 A 2×100ml

紅細(xì)胞裂解液 100ml

說(shuō)明書(shū) 1 份

操作方法：：：：

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份 A 液之液面上；或取

1ml 組織單細(xì)胞懸液（具體制備方法詳見(jiàn) 9.組織單細(xì)胞懸液的制備）小心加于 1 份 A 液

之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)。

此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環(huán)狀乳白色的單個(gè)

核細(xì)胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細(xì)胞 富集一定量的中性粒細(xì)胞 富集一定量的中性粒細(xì)胞）。。。。第四層；為紅細(xì)胞層。棄去*層血漿層及第二層細(xì)胞，收集第三層分離液層和第四層紅細(xì)胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細(xì)胞層,放入含細(xì)胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉(zhuǎn)/分）離心30 分鐘。沉淀經(jīng) 1 次洗滌后用紅細(xì)胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細(xì)胞，再經(jīng) 3 次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細(xì)胞即為所需中性粒細(xì)胞。

注：A.提取率約為 80%。 注

B. 紅細(xì)胞裂解過(guò)程詳見(jiàn)“10.紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明”。

13. . . . 參考文獻(xiàn)

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案例分析：人乙肝表面抗原（HBsAg）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定相關(guān)液體樣本中乙肝表面抗原（HBsAg）的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人乙肝表面抗原（HBsAg）水平。用純化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入乙肝表面抗原（HBsAg），再與HRP標(biāo)記的乙肝表面抗原（HBsAg）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乙肝表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人乙肝表面抗原（HBsAg）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為90 IU/L,60 IU/L ,30 IU/L, 15 IU/L, 7.5 IU/L）。

2.       加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.       溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.       配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.       洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.       加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7.       溫育：操作同3。

8.       洗滌：操作同5。

9.       顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.    終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.    測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請(qǐng)避光保存。

7． 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，   

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。                  

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2.批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于9%和11%

檢測(cè)范圍：                                             

5IU/L -100IU/L                                       

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月